猪圆环病毒感染诊断方法

关键词：猪圆环病毒；PCR；ELISA；免疫胶体金技术

猪圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，为单股负链环状DNA病毒。该病毒粒子直径为14 nm～25 nm，为二十面体对称结构，无囊膜，是兽医学上已知动物病毒中*小的病毒之一。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，将其分为PCV-1和PCV-2两型。有关PCV引起疾病的*早报道发生在1991年的加拿大，是由PCV-2引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征。至1994年PMWS已呈广泛性流行，法国、美国、西班牙、北爱尔兰及日本相继报道了该病的发生，此后韩国、意大利、德国、丹麦、荷兰、墨西哥等国家也证实了该病的存在。我国虽然自2000年才有对圆环病毒感染猪的报道并引起重视，但对于猪血清中猪圆环病毒2型抗体所作的回顾性检测以及对猪的组织样本所作的回顾性检测结果表明，PCV-2抗体至少从1969年起就已经存在于猪群中了。临床上猪感染PCV-1很常见，普遍认为广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系，由于其无致病性，所以无法通过临床症状或病理诊断来确定是否感染PCV-1。但PCV-2与猪群中发生的多种疾病相关，有其相应的临床症状和病理表现，在临床上主要引起PMWS、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病复合征及A2型先天性震颤。PCV-2与猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原可以混合感染，致病性增强。本文综述了猪圆环病毒诊断学方法的研究进展，以供借鉴。

摘 要：猪圆环病毒分为1型和2型。目前还没有证据表明猪圆环病毒1型可以导致猪发病，但其在PK-15细胞中的广泛污染和在猪群中的高感染率已经引起了人们的高度关注，而猪圆环病毒2型的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到损害，这种可导致机体免疫抑制的病毒，由于经常以亚临床感染的形式出现，常易被忽视。为了更好地控制猪圆环病毒的感染，迫切需要寻找一种适合的快速准确的诊断方法。但目前在临床诊断和实验室的诊断过程中，单一的诊断方法往往受到多种因素的影响，这就需要根据目前各种检测猪圆环病毒的方法及其优缺点进行分析，应用多种方法相结合，优化检测手段，为寻找一种适合的快速准确的诊断方法、制定合理的免疫程序和发展新型的诊断方法提供参考。

1 猪圆环病毒感染的临床诊断

猪感染PCV-2后主要表现为渐进性消瘦，生长迟缓，采食量下降，被毛粗乱，精神差，相当一部分猪只出现呼吸困难呈腹式呼吸，少数猪只有拉稀症状，有的猪出现贫血，个别猪出现黄疸症状；PCV-2感染猪引起的CT，震颤为双侧，影响骨骼肌肉，当卧下或睡觉时震颤消失，外界刺激可引发或加重震颤，有的在整个生长和发育期间都不断发生震颤；PCV-2感染猪引起PDNS的临床症状常见为皮肤发生圆型或不规则的隆起，呈现红色或紫色**为黑色病灶。

2 猪圆环病毒感染的病理学诊断

猪感染PCV-2后，*显著的剖检病变是全身淋巴结，特别是腹股沟淋巴结、纵隔淋巴结、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结及下颌淋巴结肿大2倍～5倍，有时可达10倍；肺脏肿胀、坚硬或似橡皮，部分病例形成固化、致密的病灶。严重病例肺泡出血，肺呈紫褐色，有的肺尖叶和心叶萎缩或实质性病变；半数病例为轻度到中度的肝萎缩，花斑肝。肝小叶间结缔组织增生明显；脾脏常肿大，呈肉样变化；肾为花斑肾，水肿，呈灰白色，被膜下有时有白色坏死灶；胃的食管部黏膜水肿和非出血性溃疡；回肠和结肠段肠壁变薄，盲肠和结肠黏膜充血和出血。另外，经常见到由继发感染引起的胸膜炎、腹膜炎、心包炎和关节炎。当发现猪全身淋巴结肿大，肺退化不全或形成固化、致密病灶时，应怀疑为PCV-2感染。如病理组织学检查可见全身淋巴组织的淋巴细胞减少，单核*噬细胞浸润及形成多核*细胞，并在这些细胞中观察到嗜碱性或两性染色的细胞质内包涵体，则基本可以确诊。

3 猪圆环病毒感染的实验室诊断

3.1 电镜法

利用电镜技术可以直观、准确的鉴别病毒，根据病毒本身所具有的形态、结构和大小等不同特征，可即刻做出诊断。Stevenson*次在透射电镜下对被PCV-2持续感染的PK-15细胞内的PCV-2进行超微结构的观察，并详细描述了在细胞的细胞浆与细胞核内的病毒包涵体及病毒粒子的形态。郎洪武从发病猪的脾脏和淋巴结组织的超薄切片中观察到了大量直径17 nm、圆形、无囊膜的PCV病毒粒子。

3.2 免疫组织化学检测技术

Sorden等采用纯化的PCV-2抗原免疫兔子，得到兔抗PCV-2高免血清。利用此高免血清结合福尔马林固定石蜡包埋组织中的PCV-2抗原，再采用生物素标记的抗兔二抗与兔血清结合，*后用过氧化物酶标记的链霉素染色。他们应用此法发现阳性细胞内存在大量浓染的圆形结构，大小和形状与包涵体相似。Chianini等也用兔抗PCV-2的阳性血清建立了免疫组织化学检测技术。Magar等为了克服内源性过氧化物酶对检测结果的影响，将过氧化物酶标记的第二抗体改用免疫胶体银标记，取得了更好的检测效果。

3.3 免疫荧光技术

免疫荧光技术可用于PCV的抗体检测及抗原组织定位的研究。Allan利用接免疫荧光来检测PCV，就是将组织病料以盖玻片在PK-15细胞中培养，丙酮固定，用兔抗PCV高免血清与细胞培养物中的PCV 反应，可对PCV 进行检测和分型。崔尚金等将接种PCV-2且经多次传代的PK-15细胞分散到96 孔细胞培养板上，制成抗原诊断板，检测血清中PCV-2的抗体。现在一般认为IFA是实验室检测PCV-2的一种快速、灵敏、成本低的方法，但操作上较复杂，不宜作为临床快速诊断。

3.4 酶联免疫吸附试验诊断方法

酶联免疫吸附试验可以检测抗体，也可以检测抗原，具有灵敏、简单、快捷的特点。采用Walker等的竞争ELISA来检测PCV-2抗体，此法的检出率为99.58%。Allan等也利用单抗建立了抗原捕获ELISA来检测PCV-2特异性抗体。琚春梅等利用PCV-2-ORF2基因原核表达产物建立了ELISA检测方法。崔尚金等以重组杆状病毒表达PCV衣壳蛋白作为ELISA抗原，提高了HRP标记的二抗的稀释倍数，降低了背景的非特异性。林彦星等应用原核表达的PCV-2 Cap蛋白建立了间接ELISA。张晓勇等利用巴斯德毕赤酵母**表达PCV-2-ORF2基因编码蛋白建立了。